В 2014 г. ученые были удостоены Нобелевской премии по химии за разработку наноскопии - метода биовизуализации со сверхразрешением, позволяющего наблюдать отдельные молекулы. Однако с ее помощью можно было делать только моментальные снимки в течение нескольких десятков секунд. Вдохновившись этой методикой, группа исследователей разработала концепцию сверхразрешения "PINE", позволяющую продлить наблюдения до 250 часов, раскрывая ранее невиданные молекулярные детали деления клеток. В природе любая структура, живая или иная, формируется и организуется путем сборки миллиардов отдельных компонентов. Эта динамика сборки распространяется как минимум на 3 порядка по размеру или длине и как минимум на 5 порядков по времени. Сверхразрешение произвело революцию в биоимиджинге, позволив исследовать эту динамику до масштабов не более 10 нанометров, что соответствует разрешению в 100 атомов.
В общем случае существующие методы сверхразрешения предполагают намеренное вызывание фотообесцвечивания. Цель этого процесса - осветить молекулы, меченные флуорофором (флуоресцентным маркером), так, чтобы они отражали свет, который через несколько десятков секунд исчезает. Несмотря на высокое разрешение изображений, реконструированных из точек флуоресценции, этот протокол вызывает необратимую деградацию и значительно ограничивает время наблюдения, что не является идеальным для наблюдения за биомолекулярными процессами в течение длительного времени. "Живая клетка - это оживленное место, в котором то тут, то там появляются ожившие белки. Наша система сверхразрешения очень привлекательна для визуализации этой динамической активности", — отмечает в пресс-релизе Гуанджи Цуй (Guangjie Cui), аспирант кафедры электротехники и вычислительной техники Мичиганского университета и один из разработчиков новой методики. Новая методика, подробно описанная в журнале Nature Communications, позволяет расширить диапазон наблюдения с суперразрешением до 250 часов.
Слева: обзор белков без сверхразрешения. Справа: белки с суперразрешением.
Устройство, разработанное Цуи и его коллегами, представляет собой наноскоп с фазовой интенсивностью без отбеливания (PINE). Он включает интегрированную многослойную тонкую пленку на основе поливинилового спирта и жидкокристаллических полимеров. Эта пленка позволяет случайное распределение золотых нанозондов, используемых вместо флуорофоров, и позволяет избежать фотообесцвечивания. Предыдущие исследования показали, что метод нанозондов обеспечивает упругое рассеяние света без обесцвечивания, что позволяет получить более длительное сверхразрешение. Однако эти методы были склонны к смещению, что снижало точность сверхразрешения. Кроме того, можно было использовать всего несколько нанозондов, тогда как для оптимальной реконструкции изображений наблюдаемых структур необходимы тысячи. Более того, им не удалось достичь уровня сверхразрешения менее 10 нанометров.
Протокол исследователей из Мичигана позволяет использовать популяцию из нескольких тысяч нанозондов и, таким образом, предлагает разрешение менее 10 нанометров. Наностержни реагируют на свет, который полимерная пленка позволяет обнаруживать при отражении в соответствии с точной фазой. Такая точность позволяет выбирать наностержни в зависимости от угла падения света. Записав от 10 до 30 изображений, каждое из которых было снято под разным углом наностержня, и объединив их в одно изображение, команда смогла наблюдать детали белкового масштаба в клетке. Для сравнения, в обычном микроскопе эти детали были бы размыты. "Мы можем проводить долгосрочную наноскопию размером менее 10 нм и следить за возникновением крупномасштабных коллективов, включающих сотни клеточных архитектур (> 900) в клетках, что невозможно получить с помощью существующей флуоресценции", — говорится в их исследовании.
Увеличение невиданных ранее деталей
Для проверки новой методики ученые попытались обнаружить актин - нитевидный белок, поддерживающий клетки, диаметром около 7 нанометров. Несмотря на то, что нанотиды примерно в два раза меньше белков, они раскрывают беспрецедентные подробности процесса деления клетки. Хотя мы понимаем основы этого процесса, он остается во многом загадочным из-за ограниченности технологий наблюдения. Методика PINE позволила наблюдать набор из 904 актиновых филаментов и показала, что во время деления клетки они расширяются, удаляясь друг от друга. Затем это расширение приводит к их сближению, что позволяет им вновь соединиться. Этот процесс сдерживается тенденцией белковой сети к расширению и привлечению других соседних белков. В результате результирующая сеть имеет тенденцию сжиматься тем сильнее, чем больше в ней связей, и расширяться, если в ней меньше связей.
Также было обнаружено, что поведение актина тесно связано с поведением клетки. Когда белковая сеть расширяется, клетка-хозяин сжимается. Но в противоположном случае клетка-хозяин сжимается, когда белки расширяются. Такая противоречивая динамика наблюдается впервые, и исследователи надеются понять ее последствия и возможное влияние в ближайшем будущем. В частности, дерегуляция этого процесса может лежать в основе некоторых патологий.
Автор: new-science.ru
Заглавное фото из открытых источников
