Международная группа ученых из России и Германии открыла механизм работы на атомном уровне важного клеточного белка бактериородопсина. Оказывается, с помощью света белок организует «протонные провода» для создания потенциала на мембране и подзарядки клетки. К открытию ученые шли несколько лет, проверяя и суммируя всю накопленную информацию и разрабатывая собственную уникальную методику исследований.
Статья опубликована в высокорейтинговом научном журнале Nature Structural & Molecular Biology. Бактериородопсин — один из самых изученных белков в современной науке. Он был открыт более 40 лет назад. Этот белок — важное звено при производстве АТФ, основной энергетической единицы клетки. Для синтеза АТФ на мембране создается электрический потенциал: с одной стороны много протонов водорода, с другой — мало.
Бактериородопсин — один из белков, задействованных в этом процессе. Он поглощает свет и использует энергию фотонов для переноса протонов с одной стороны мембраны клетки на другую. Благодаря способности этого белка изменяться при помощи света было разработано множество исследовательских методик.
Он лежит в сердце всей оптогенетики, уникальной методики управления нейронами с помощью света, которая сейчас очень активно развивается. К данному моменту сделаны тысячи исследовательских работ о бактериородопсине. Но, несмотря на все это, до сих пор оставалось непонятным, как работает сам белок.
Дело в том, что бактериородопсин — это мембранный белок, и он сложно поддается кристаллизации, основному методу изучения белков. Со временем эта проблема была решена, но ученым никак не удавалось однозначно установить так называемые переходные состояния. Можно сравнить функционирование белка с машиной. Когда он работает, как любая машина, он может находиться в состоянии 1, 2, 3, 4 или 5. При переходе из одного состояния в другое что-то меняется в его структуре. Когда машина едет, движутся какие-то шестеренки, что-то крутится.
Можно, снимая кадр за кадром: сначала первый, через секунду — второй, третий, четвертый — проследить за тем, как работает машина. Она катится за счет того, что где-то поршни двигаются, где-то крутятся шестеренки, где-то срабатывают переключатели. Именно по такому принципу ученые пытаются изучить работу белков. Но, поскольку речь идет об атомном уровне, приходится задействовать процедуры, технически сложно реализуемые.
Многие научные группы работали в этом направлении с бактериородопсином, но у всех были свои проблемы: качества данных всегда не хватало для того, чтобы сформировать непротиворечивую единую картину того, как работает белок. Группе ученых под руководством Валентина Горделия удалось это сделать.
«Нам удалось установить, что для того, чтобы белок работал, в нем должны образовываться “протонные провода”, которые соединяют некие ключевые места, где происходят изменения в этой молекуле. По ним идет передача сигнала и протонов из одного места белка в другое. Бактериородопсин поглощает фотон, за счет этой энергии в нем происходят структурные перестройки, в процессе которых протон оказывается перенесенным с одной стороны мембраны на другую.
Чтобы это произошло, аминокислоты, из которых он состоит, неким образом перестраиваются. Вот именно эти перестройки нам удалось увидеть и потом объяснить, почему по этим протонным проводам начинают бежать протоны. Как, каким образом задается потенциальная сила, которая перетаскивает протон с одной стороны на другую», — рассказывает Валентин Борщевский, заместитель директора Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ.
Ученые международной группы задействовали несколько подходов. Основным был метод рентгеноструктурного анализа. С его помощью можно узнать, как устроена молекула, где какой атом у нее находится. Но для того, чтобы понять, как она изменяется в ходе своей работы, нужна уже спектроскопия.
На созданные кристаллы светили лазером, и белок внутри начинал работать. Его рабочий цикл равен порядка 10 миллисекунд, за это время он проходит полный оборот изменений и возвращается в начало. Ученые центра МФТИ научились «схватывать» состояния молекулы. Были разработаны методы, которые позволили фиксировать белок в нужной позиции, чтобы «рассмотреть» изменения.
Для этого кристаллы белка замораживали и затем возбуждали светом. В зависимости от температуры белок мог пройти до первого состояния и остановиться на нем. Когда температуру делали повыше, он мог пройти первое состояние и перейти во второе. Таким образом, изменяя и фиксируя температуру, ученые накапливали кристаллы с определенным состоянием белка и изучали их.
В мире много научных команд, которые бьются над аналогичной задачей. Валентин Борщевский поясняет:
«Нам было необходимо не только экспериментально описать и осмыслить наши результаты, но и непротиворечиво вписать их в огромный пул данных, который уже существует. В частности, разобрать основные ошибки в имеющихся исследованиях».
В каких-то случаях в работах описаны артефакты, которые получились на самом деле из-за радиационного повреждения образца.
Рентген — это ионизирующее излучение, и при проведении рентгеноструктурного анализа образец легко повредить. Если за этим не следить, то можно принять повреждения образца за реальные изменения. В других случаях увеличивали интенсивность света настолько, что лазером создавались артефакты, которые далее изучались. С каждой из ошибок ученым пришлось разобраться.
Валентин Борщевский добавляет:
«Ранее у нас вышла серия из нескольких статей, в которой мы каждую из проблем в экспериментах отдельно охарактеризовали. Была еще проблема двойникования кристаллов. Не буду вдаваться в детали, смысл в том, что, когда ты выращиваешь кристаллы, можешь не заметить, что они растут не такими, как надо. Это тоже создает артефакты при простом анализе. После того как мы разобрались с этими проблемами, поняли, как их обходить, можно было приступить к созданию непротиворечивой модели работы, собственно, бактериородопсина. В результате появилась эта публикация как результат многолетнего труда».
